பயோ-டீசல் விலங்கு கொழுப்பு அல்லது தாவர எண்ணெயில் இருந்து பெறப்படுகிறது. இது நீண்ட சங்கிலி கொழுப்பு அமிலத்தைக் கொண்டுள்ளது, அவை பொதுவாக மோனோ-அல்கைல் எஸ்டர் ஆகும். பயோ-டீசல்கள் டிரான்செஸ்டரிஃபிகேஷன் எனப்படும் ஒரு செயல்முறையால் உற்பத்தி செய்யப்படுகின்றன. இந்த செயல்முறையின் போது தாவர எண்ணெயிலிருந்து கிளிசரின் அகற்றுவோம், இது மீதில் எஸ்டர் (அதாவது) பயோ-டீசல் மற்றும் கிளிசரின் ஆகியவற்றை உருவாக்கும். பயோ-டீசலை தனியாகப் பயன்படுத்தலாம், ஆனால் பெரும்பாலும் இது மற்ற சேர்க்கைகளின் சிறிய விகிதத்துடன் இணைக்கப்படுகிறது.